|
Zvara Ágnes
A DNS-chipek és alkalmazásuk
A huszadik század második feléig a gének funkciójának és szabályozásának tanulmányozása egyedi gének lépésről lépésre történő vizsgálatán alapult. Tekintve, hogy egyre több organizmus genomjának szekvenciája vált és válik teljesen vagy részlegesen ismertté, egy új tudományág, a funkcionális genomika fejlődött ki, mely nagyszámú, akár a sejtben lévő összes gén működését, funkcióját egyszerre vizsgálja. Új, nagy áteresztőképességű molekuláris módszerek fejlődtek ki, melyek alkalmasak a sejten belüli összetett kölcsönhatások vizsgálatára. Az utóbbi évek nagy technikai fejlesztése, a "microarray"- vagy "biochip"-technológia ma már lehetővé teszi, hogy a sejtekben lezajló különböző biológiai folyamatokról - mint mutációk létrejötte, gén- és fehérjekifejeződés,* a genomban történő változások, illetve a különböző fehérje-fehérje kölcsönhatások - átfogó képet nyerjünk. A "biochipek" olyan kémiailag aktivált üveglemezek, melyek felületére nagyszámú oligonukleotid, cDNS**, fehérje vagy kis molekulasúlyú potenciális gyógyszermolekula van nagy sűrűségben nyomtatva. Ezek a kis üveglemezek rendkívül hatékony eszközei a molekuláris biológiának, hiszen segítségükkel gyors és összehasonlító képet kaphatunk a genomban, a gén- és fehérjekifejeződésben (transzkriptom, proteom) bekövetkező változásokról.
1. ábra. Egy chipkísérlet lépései
A DNS-chipek legfontosabb és leginformatívabb alkalmazása a génkifejeződés párhuzamos tanulmányozása, ami a genom funkcionálisan aktív részeire (transzkriptom) összpontosít. A technika egyik eleme a fent említett aktivált üvegfelülethez kötött, pontonként specifikus DNS-molekula halmaz, a DNS-chip, míg másik eleme a kérdéses biológiai mintákból (szövet, vagy sejtkultúra) nyert mRNS illetve az ebből származó fluoreszcensen jelölt cDNS. A DNS-oldat speciális nyomtató robot segítségével, nagyfokú precizitással, akár 150-200 mikron távolsággal 1-2 nanoliter térfogatú cseppek formájában kerül az aktivált üveglemez felületére. Ha a jelölt cDNS-szálakat adott, kedvező körülmények között chipre hibridizálják, a bázisok komplementartitása alapján a megfelelő, immobilizált komplementer DNS, melyhez a jelölt próba kapcsolódott, konfokális lézerszkennerrel detektálható (1. ábra). A két mintát (patológiás-normál, kezelt-kezeletlen) különböző fluoreszcens festékkel jelölve, majd egy chipre hibridizálva minden egyes génspecifikus minta esetében összehasonlítható a génkifejeződés mértéke (2. ábra). A génkifejeződési különbségek matematikai analízis után meghatározhatók. Használatukkal bármilyen környezeti hatás, genetikai illetve a sejtműködésben bekövetkező (akár kóros) változások nyomon követhetők a génkifejeződés szintjén egyetlen hibridizációs lépésben. Megállapítható egy szövet expressziós mintázata, egyfajta „molekuláris ujjlenyomata”, ami a sejt aktuális állapotát tükrözi. A chiptechnológia segítségével a korábbi módszerekhez képest sokkal hatékonyabban tanulmányozhatjuk egy adott állapotra (kóros, gyógyszerrel kezelt, környezeti hatásokra fellépő állapotok) jellemző génműködési mintázatot, azonosíthatjuk az adott állapotot kiváltó géneket. Ezek az információk mind az alap, mind az alkalmazott kutatásban, gyógyszerfejlesztésben kamatoztathatók, hiszen az így megtalált gének potenciális gyógyszercélpontok, egy adott betegségre jellemző molekuláris markerek lehetnek.
2. ábra. Jelölt próba készítése: két különböző minta együttes analízise
A Szegedi Biológiai Kutatóközpont Funkcionális Genomika Laboratóriuma 1999 óta sikerrel alkalmazza a biochip technológiát. A hároméves OTKA posztdoktori pályázat keretében ezen technika további alkalmazását és optimalizálását tűztük ki célul. Sikeresen kifejlesztettünk egy olyan módszert, amellyel igen kis mennyiségű biológiai mintából fluoreszcens jelölés segítségével a DNS-chiptechnológiában alkalmazható minta képezhető nagyfokú reprodukálhatósággal. Ez a technikai előrelépés nagyon fontos olyan szöveti elváltozások vizsgálatában, amikor csak korlátozott mennyiségű biológiai minta áll rendelkezésünkre. A pályázat hároméves időtartama olyan patkányspecifikus DNS-chipet hoztunk létre, mely alkalmas a különböző környezeti hatásokra aktiválódó gyulladásos folyamatok génexpresszió szintű tanulmányozására. Továbbfejlesztettük a chiptechnológiát, valamint az adatfeldolgozás statisztikai és bioinformatikai alapjait, optimalizáltuk a mintajelölés és a hibridizálás különböző lépéseit.A sejtek mindenre kiterjedő expresszióvizsgálata során így mód nyílt a gyulladási folyamat egyes lépéseinek a tanulmányozására, a folyamatban résztvevő gének azonosítására és jellemzésére. A differenciáltan kifejeződő gének azonosításával a jövőben lehetőség nyílik arra, hogy a gyulladási folyamatokat megismerve új biokémiai utakat tárjunk fel, melyek fontos információkat adhatnak új és hatékony gyulladáscsökkentő gyógyszerek kifejlesztéséhez.
Létrehoztunk továbbá egy humán limfocitaspecifikus DNS-chipet, melynek segítségével korunk egyik leggyakoribb pszichiátriai betegségére, a szkizofréniára kerestünk perifériás genetikai markereket. A betegség előfordulása az európai népességben ma megközelíti az egy százalékot. Diagnosztizálása összetett klinikai tünetek alapján történik; a diagnózis kritériuma a tünetek tartós, legalább 6 hónapon keresztül tartó fennállását is magában foglalja. Ma már tudjuk, hogy több, a központi idegrendszerben ingerületátvivő anyagként szerepet játszó vegyület (dopamin, szerotonin, glutamát), illetve ezen vegyületek szintéziséhez és metabolizálásához szükséges fehérjéket kódoló gének a limfocitákban is kifejeződnek. Vizsgálataink - ezt a tényt kihasználva - arra irányultak, hogy az egyedi vérmintákból származó limfociták génexpressziós mintázatát összehasonlítva olyan, a szkizofréniára jellemző genetikai markereket keressünk, amelyek a betegség pontos és gyors diagnosztizálását teszik lehetővé. Sikeresen alkalmazva a DNS-chiptechnológiát két markergént azonosítanunk gyógyszermentes, „drug naiv” betegcsoportokon, melyeket szabadalmaztattunk. A gyógyszermentes állapot jelentős előnyt jelent a kutatásban, hiszen a gyógyszeres kezelés befolyásolhatja a génkifejeződést. Reményeink szerint a jövőben ezek és esetleg további markarek ennek a betegségnek a diagnosztizálását és a gyógyszeres kezelést segíthetik.
****
*A génkifejeződés
Génkifejeződésnek hívjuk azt a folyamatot, melynek során egy gén aktiválódik és róla mRNS (messenger, hírvivő RNS), majd fehérje íródik át, tehát az adott gén megnyilvánul, kifejeződik. A mRNS- és fehérjepopuláció összetétele minden percben más és más, függ a sejt adott állapotától. A DNS-chiptechnológia egyik legfontosabb alkalmazási területe éppen ezen mRNS-populáció összetételének vizsgálata. A génkifejeződési mintázat tehát egy adott pillanat aktív génjeinek mintázata.
**cDNS
A cDNS (copyDNS) a mRNS-ből egy enzimatikus reakció során keletkező egyszálú DNS, mely szekvenciáját tekintve azonos a mRNS-sel (kivéve az uracil-timin nukleotidcserét). A reakciót egy ún. reverz transzkriptáz enzim végzi, mely képes az RNS-szálat alapul használva megfelelő szabad nukleotidok jelenlétében az eredeti szállal komplementer DNS-szálat szintetizálni. Erre az átalakításra azért van szükség, mert az RNS-molekula igen sérülékeny, könnyen lembomlik, degradálódik, ezért nehezen kezelhető. Ez a cDNS-szál reprezentálja bizonyos kísérleti rendszerekben - így a DNS-chiptechnikában is - a mRNS-molekulát, tükrözve ezáltal a génkifejeződési mintázatot.
|
AJÁNLOM AZ OLDALT
